固態(tài)納米孔：下一代DNA測(cè)序技術(shù)原理、工藝與挑戰(zhàn)編輯推薦： 相比傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù),固態(tài)納米孔測(cè)序技術(shù)在成本、速度等方面有著十分巨大的優(yōu)勢(shì). 然而,作為一種新興的測(cè)序技術(shù),固態(tài)納米孔在制造、測(cè)序、集成
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相比傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù), 固態(tài)納米孔測(cè)序技術(shù)在成本、速度等方面有著十分巨大的優(yōu)勢(shì). 然而, 作為一種新興的測(cè)序技術(shù), 固態(tài)納米孔在制造、測(cè)序、集成等方面也存在著諸多挑戰(zhàn).來自中科院的學(xué)者就這一方面發(fā)表了綜述，主要介紹了納米孔測(cè)序技術(shù)的原理、制備工藝和面臨的挑戰(zhàn), 并展望了未來納米孔測(cè)序技術(shù)的發(fā)展前景。 固態(tài)納米孔測(cè)序技術(shù)作為新興的第四代 DNA測(cè)序技術(shù), 具有低成本、高讀長(zhǎng)、易集成等優(yōu)勢(shì). 如今, 隨著半導(dǎo)體工藝技術(shù)的飛速發(fā)展, 小型化、高速度、大通量的納米孔測(cè)序芯片的實(shí)現(xiàn)成為可能. 相比傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù), 固態(tài)納米孔測(cè)序技術(shù)在成本、速度等方面有著十分巨大的優(yōu)勢(shì). 然而, 作為一種新興的測(cè)序技術(shù), 固態(tài)納米孔在制造、測(cè)序、集成等方面也存在著諸多挑戰(zhàn).來自中科院的學(xué)者就這一方面發(fā)表了綜述，主要介紹了納米孔測(cè)序技術(shù)的原理、制備工藝和面臨的挑戰(zhàn), 并展望了未來納米孔測(cè)序技術(shù)的發(fā)展前景。  
DNA 測(cè)序技術(shù)作為人類探索生命秘密的重要手段之一, 對(duì)生物、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用. 自從誕生以來, DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了幾代技術(shù)的變革. 第一代技術(shù)使用的是1977年Sanger等人發(fā)明的鏈終止法或Maxam和 Gilbert發(fā)明的鏈降解法, 因?yàn)槠涑呔炔⒖梢詮念^測(cè)序、從頭組裝的特點(diǎn), 以此為基礎(chǔ)的毛細(xì)管電泳測(cè)序方法在特定領(lǐng)域仍有著不可取代的作用. 

第二代技術(shù)作為目前市場(chǎng)上主流的 DNA 測(cè)序技術(shù), 較第一代測(cè)序技術(shù)而言, 測(cè)量通量明顯提高. 如Roche454 公司的 GS FLX 基因測(cè)序系統(tǒng), Illumina 公司的 HiSeq/MiSeq/Genome Analyser 系統(tǒng), Life Technologies 公司的 5500xl SOLiD 系統(tǒng). 此外, 被稱為第2.5代的Helicos公司的HeliScope系統(tǒng)在第二代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上引入了單分子測(cè)序的概念, 在速度和成本方面較之前有了一定進(jìn)步. 

第三代技術(shù)以Pacific Biosciences 公司的 RS 系統(tǒng)為代表, 以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序?yàn)橹饕攸c(diǎn), 對(duì)零模波導(dǎo)中的單個(gè)熒光分子進(jìn)行高靈敏度檢測(cè), 從而快速獲得 DNA序列信息. 

納米孔測(cè)序技術(shù)屬于第四代測(cè)序技術(shù), 其通過物理方法, 無(wú)需生物化學(xué)預(yù)處理而直接對(duì) DNA 序列進(jìn)行讀取, 正向著高通量、高讀長(zhǎng)、低成本、小型化的方向發(fā)展.
納米孔測(cè)序技術(shù)原理  
納米孔測(cè)序方法不同于其他測(cè)序方法, 不需要對(duì) DNA 進(jìn)行生物或化學(xué)處理, 而采用物理辦法直接讀出 DNA 序列. 其原理可以簡(jiǎn)單的描述為: 單個(gè)堿基通過納米尺度的通道時(shí), 會(huì)引起通道電學(xué)性質(zhì)的變化. 理論上, A, C, G, T 4 種不同的堿基化學(xué)性質(zhì)的差異會(huì)導(dǎo)致它們穿越納米孔時(shí)引起的電學(xué)參數(shù)的變化量也不同, 對(duì)這些變化進(jìn)行檢測(cè)可以得到相應(yīng)堿基的類型.
目前用于DNA測(cè)序的納米孔可以大致分為2類生物納米孔和固態(tài)納米孔. 由于 DNA 鏈的直徑非常小(雙鏈 DNA 直徑約為 2 nm, 單鏈 DNA 直徑約為1 nm), 所以對(duì)所采用的納米孔的尺寸有著近乎苛刻的要求. 生物納米孔多采用的是α溶血素(一般嵌入在雙層脂膜當(dāng)中), 其最窄處直徑尺寸約為 1.5 nm,恰好允許單鏈 DNA 分子通過, 并且大小嚴(yán)格一致。  
然而生物納米孔在膜穩(wěn)定性、 電流噪聲等方面的問題在一定程度上限制了其發(fā)展. 牛津納米孔公司在蛋白納米孔的應(yīng)用方面取得了一定進(jìn)展, 他們的GridION和MinION系統(tǒng)就是基于蛋白納米孔的測(cè)序平臺(tái). 固態(tài)納米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成, 一般使用離子束或電子束在硅或其他材料薄膜表面鉆出納米尺度的孔洞, 再進(jìn)一步對(duì)孔的形狀和大小進(jìn)行修飾而成.
相比于生物納米孔, 固態(tài)納米孔在穩(wěn)定性、電流噪聲、工藝集成方面有著顯著的優(yōu)勢(shì), 但是因?yàn)槭芟抻谌缃竦陌雽?dǎo)體工藝制造水平, 固態(tài)納米孔的制造還較為復(fù)雜與昂貴.   
固態(tài)納米孔工藝 

固態(tài)納米孔的制作與半導(dǎo)體工藝的結(jié)合使得DNA測(cè)序芯片的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能. 2001年, Li等人使用聚焦離子束在 Si3N4 薄膜上制作出了直徑61 nm 的孔, 隨后又采用 Ar將孔徑縮小到了 1.8 nm.2003年, Storm等人用高能電子束在SiO2薄膜上制作出了直徑 2 nm 的孔. 如今, 人們已經(jīng)可以在很多材料上制作出亞 10 納米尺度的固態(tài)納米孔, 例如,SiNx, SiO2,SiC, Al2O3等. 此外, 石墨烯因其本身超薄的結(jié)構(gòu)和特殊的電子特性也作為薄膜材料的一種新選擇, 它的超薄的單原子層結(jié)構(gòu)十分適合隧道電流的測(cè)量. 納米電極制作  納米電極的制作在測(cè)序用納米孔制造工藝中也是一項(xiàng)重要的挑戰(zhàn). 前文提到, 納米電極的形狀、與納米孔重合度的好壞直接影響到電流信號(hào)的好壞, 因此要在納米尺度制作出形狀規(guī)則、 電學(xué)特性良好的電極并不容易.  
目前研究者們所做的工作都是在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)單個(gè)納米孔進(jìn)行研究, 而無(wú)法將其運(yùn)用到商業(yè)中. 到目前為止, 還沒有辦法能夠快速制作出直徑大小均一且都在5 nm以下的納米孔陣列, 在DNA測(cè)序芯片向商業(yè)化轉(zhuǎn)變的道路上, 這是必須解決的一個(gè)問題. 但是, 相信隨著半導(dǎo)體制造工藝和納米電子學(xué)的不斷發(fā)展, 人們一定會(huì)制作出高質(zhì)量的納米孔芯片.
面臨挑戰(zhàn)與發(fā)展前景  雖然納米孔測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)十分明顯, 與前幾代技術(shù)相比在成本、速度方面有著很大優(yōu)勢(shì), 但是目前還處在起步階段, 從測(cè)序原理到制造工藝都存在有許多問題, 許多技術(shù)也都只停留在理論階段. 這篇文章列舉了目前納米孔測(cè)序技術(shù)中遇到的一系列挑戰(zhàn)以及研究者們針對(duì)這些挑戰(zhàn)提出的解決辦法. 原文摘要：
陳文輝, 羅軍, 趙超. 固態(tài)納米孔: 下一代DNA測(cè)序技術(shù)—原理、工藝與挑戰(zhàn). 中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué), 2014, 44: 649–662
Chen W H, Luo J, Zhao C. Solid-state nanopore: the next-generation sequencing technology—principles, fabrication and challenges. SCIENTIA SINICA 
Vitae, 2014, 44: 649–662, doi: 10.1360/N052014-00091